免疫荧光技术在食品检测中的应用(1)

时间:2019-03-05 07:26:24 来源: 凤凰彩票 作者:匿名


免疫荧光测定(IFA)最初建立于20世纪40年代早期。 1942年,Coons等人。报道了使用荧光素异硫氰酸酯标记的抗体来检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。由于该荧光素标记物的性能较差,尚未得到推广。直到20世纪50年代末,里格斯等人。 (1958)合成了合成的黄色硫氰酸盐。 Mashall等人。 (1958)进一步改进了荧光抗体的标记方法,从而逐步应用免疫荧光技术。免疫荧光细胞化学技术使用用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针来检测待测组织或细胞样品中的靶抗原(或抗体),并向所得抗原 - 抗体复合物提供荧光素。在荧光显微镜下,由于高压汞灯源的紫外线,荧光素发出明亮的荧光,因此可以区分抗原(或抗体)的位置和性质,并且抗原含量可以通过荧光定量技术。为了达到定位,定性和定量测定抗原物质的目的。

一,基本原则

当抗体与荧光素结合时,它不影响与相应抗原的特异性结合反应。将待测抗原预先固定在载玻片上,滴加荧光标记的抗体。如果荧光标记的抗体与相应的抗原特异性结合,不能被缓冲液洗掉,荧光显微镜下可以观察到荧光,否则荧光抗体会被缓冲液洗掉,荧光显微镜下不会发现荧光。

第二,抗体的荧光标记

荧光意味着分子或原子吸收给定的能量,并立即引起发光;当能量供应停止时,发光也停止。荧光素是一种有机化合物,它吸收激发光的光能并将其作为染料产生。它也被称为荧光颜料。目前用于标记抗体的荧光素主要包括异硫氰酸荧光素(fTTC),四乙基罗丹明和罗丹明四甲基异硫氰酸酯。

(1)荧光抗体的制备

用于标记的抗体需要高度特异性和高度亲和性。使用的抗血清不应含有抗标本中正常组织的抗体。通常需要在提取IgG后进行纯化。标记的荧光素应满足以下要求:1应具有能够与蛋白质分子形成共价键的化学基团,并且在与蛋白质结合后不易离解,而未结合的色素及其降解产物易于被删除; 2高荧光效率与蛋白质结合后,仍保持高荧光效率; 3种荧光色与背景组织形成鲜明对比; 4与蛋白质结合后不影响蛋白质的原始生化和免疫学特性; 5标记方法简单,安全,无毒; 6与蛋白质的组合稳定且易于储存。标记蛋白质的常用方法包括搅拌和透析。以FTTC标签为例,搅拌标记方法为:首先,用0.5 mol/L pH 9.0碳酸盐缓冲液平衡待标记的蛋白质溶液,然后在磁力搅拌下滴加人FTTC溶液,搅拌在室温下继续。离心6小时后,上清液为标记物。该方法适用于标记具有大样品量和高蛋白质含量的抗体溶液。优点是标记时间短,荧光素量少。然而,这种方法有许多影响因素,如果处理不当,会引起强烈的非特异性荧光染色。

透析方法适用于标记具有少量样品和低蛋白质含量的抗体溶液。该方法更均匀,非特异性染色也更低。该方法包括以下步骤:首先将待标记的蛋白质溶液加载到透析袋中,并将其置于含有FTTC的0.01lmol/L pH 9.4碳酸盐缓冲溶液中过夜,然后通过PBS透析除去游离色素。低速离心并取上清液。

标记完成后,还应进一步纯化标记的抗体,以除去未结合的游离荧光素和与荧光素结合过多的抗体。纯化方法可以是透析方法或色谱分离方法。

(II)荧光抗体的鉴定

应在使用前确定荧光抗体。鉴定指标包括效力和荧光素与蛋白质结合的比例。抗体滴度可通过琼脂双扩散法测定,滴度大于10×177b。确定和计算荧光素与蛋白质比率(F/P)的基本方法是将制备的荧光抗体稀释至A280l≈1.0,并分别测量A280(蛋白质特异性吸收峰)和标记荧光素的比吸收。 。峰值,根据公式计算。

F/P值越高,与抗体分子结合的荧光素越多,反之亦然。通常用于标本染色的荧光抗体优选F/P=1.5,并且F/P=2.4用于活细胞染色。

通过从10×177b(4-256)稀释荧光抗体并用荧光抗体染色切片样品来测定抗体的工作浓度。特异性荧光的最高稀释度和弱的非特异性染色是荧光抗体的工作浓度。应采取荧光抗体的保存以防止抗体失活并防止荧光猝灭。最好少量包装,-20%冷冻,以便储存3 - 4年;它也可以在4°C下储存1至2年。

三,标本的制作

在食品卫生测试中,通过将样品富集液体施加到载玻片上来制备荧光标记的抗体检测样品,涂片应该薄且均匀,干燥并化学固定,然后进行荧光染色。固定有两个目的,一个是防止试验材料从载玻片上脱落,另一个是消除抑制抗原 - 抗体反应的因素,如脂肪。最常用的固定剂是丙酮和95%乙醇。用丙酮固定后,许多病毒和细菌定位研究通常会给出良好的结果。乙醇还定位可溶性蛋白质抗原。 8%-10%的福尔马林更适合于脂多糖抗原,因为这些抗原可溶于有机溶剂。固定温度和时间应根据经验确定,通常在37°C下保持10分钟。室温15分钟或4℃30分钟。有些病毒最好在丙酮-40~-200℃下固定30min。固定后,应用PBS反复洗涤,染色后干燥后使用。

四,荧光抗体染色方法

(a)直接方法

这是荧光抗体技术的最简单和基本的方法。将荧光抗体滴加到待检样品中,反应和洗涤后,在荧光显微镜下观察。如果样品中存在相应的抗原,即,它特异性地结合荧光抗体,并在显微镜下观察荧光抗原 - 抗体复合物。该方法的优点是操作简单,特异性高。然而,缺点是每种抗原的检测需要制备相应的特异性荧光抗体,并且灵敏度低于间接方法。如图14-2所示。

(2)间接法

根据抗球蛋白试验的原理,使用用荧光素标记抗球蛋白抗体(称为标记的抗 - 抗体)的方法。检测过程分为两个步骤。首先,将待测抗体(第一抗体)应用于含有已知抗原的样品片剂一段时间,以洗去未结合的抗体;其次,逐滴加入标记的抗体。如果第一步中的抗原抗体已经结合,则标记的抗体与已经固定在抗原上的抗体(第一抗体)分子结合,形成抗原 - 抗体 - 标记的抗 - 抗体复合物,并显示特异性荧光。 。该方法的优点是灵敏度高于直接法,并且不需要制备荧光素标记的抗球蛋白抗体,并且可以用于检测同一动物的多种抗原 - 抗体系统,并且用荧光素标记葡萄球菌蛋白A.除了标记用于间接荧光染色的抗球蛋白抗体,而不受第一抗体来源的种类限制,灵敏度低于标记抗 - 抗体方法。间接方法有时容易产生非特异性荧光,这是一个缺点。该方法通常用于检测各种自身抗体,如果第一抗体是已知的,间接方法也可用于鉴定未知抗原。如图14-3所示。参考:现代食品检测技术

[关键词]免疫荧光分析,食品检测,荧光抗体,国家标准物质网络

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